Souprava PCR pro myší tkáň

Rychlá amplifikace cílového genu přímo ze vzorků zvířecí tkáně bez extrakce.

Souprava Mouse Tissue Direct PCR Kit využívá jedinečný design balení, který obsahuje všechna činidla pro rychlou přípravu genomové DNA a amplifikaci PCR. Je použitelný pro jednostupňové čištění genomu DNA z myších tkání (ocas, ucho a prst) a následnou amplifikaci a detekci PCR. Celý proces nezahrnuje homogenizaci, rozbíjení, štěpení přes noc, extrakci organickým rozpouštědlem, srážení ethanolem nebo čištění na koloně. Stabilních výsledků lze dosáhnout jednoduchými a rychlými operacemi.

2 × Dir PCR MasterMix dodávaný touto soupravou je vysoce kompatibilní PCR reagent, který může účinně a specificky amplifikovat DNA bez nutnosti odstraňování nečistot, jako jsou proteiny. Toto činidlo obsahuje hot-start upravený protilátkouTaq DNA polymeráza, dNTP, MgCl2, pufry, stejně jako zesilovač, optimalizátor a stabilizátor pro reakci PCR. PCR reakci lze provést jednoduchým přidáním nahrubo extrahovaného templátu a specifických primerů. Celý proces je rychlý, jednoduchý, citlivý, specifický a stabilní, což je zvláště vhodné pro vysoce výkonný screening. 2 × Dir PCR MasterMix obsahuje premix elektroforetické barvivo, takže produkty PCR lze po reakci přímo odeslat k detekci elektroforézy. 3 'konec produktu PCR má koncovku A, kterou lze použít pro klonování TA.

Kočka. Ne Velikost balení
4992531 20 µl × 50 rxn
4992532 20 µl × 200 rxn

Detail produktu

Pracovní postup

Experimentální příklad

FAQ

Značky produktů

Funkce

■ Jednoduché a rychlé: Genomickou DNA lze rychle extrahovat z myších tkání za 60 minut bez mletí tekutým dusíkem a extrakce organickým rozpouštědlem.
■ Široké použití: Je vhodný pro jednostupňovou extrakci genomové DNA z myšího ocasu, ucha, prstu a dalších tkání.
■ Vysoká specificita: Polymeráza Taq použitá v tomto produktu je enzym hot-start modifikovaný protilátkou s vysokou afinitou templátu a primeru a specificitou amplifikace, který je zvláště vhodný pro genotypizaci a transgenní identifikaci.
■ Detekce genů: Produkt se snadno obsluhuje se spolehlivými výsledky a je zvláště vhodný pro vysoce výkonnou analýzu a detekci myších tkání

Všechny produkty lze přizpůsobit pro ODM/OEM. Pro detaily,klikněte prosím na přizpůsobenou službu (ODM/OEM)


  • Předchozí:
  • Další:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    Workflow

    Experimental Example

    Použití soupravy Mouse Tissue Direct PCR Kit a příslušného produktu dodavatele A k amplifikaci fragmentů 1000 bp, 2000 bp a 3000 bp z myšího ocasu, myšího ucha a potkaního ocasu. Výsledek ukázal, že souprava Mouse Tissue Direct PCR Kit má lepší specificitu a úspěšnost.

    Otázka: Žádná pásma zesílení

    Šablona A-1

    ■ Šablona obsahuje proteinové nečistoty nebo inhibitory Taq atd. —— Čistěte templát DNA, odstraňte proteinové nečistoty nebo extrahujte templátovou DNA pomocí purifikačních souprav.

    ■ Denaturace šablony není úplná —— Vhodně zvyšte denaturační teplotu a prodlužte denaturační čas.

    ■ Degradace šablony —— Připravte šablonu znovu.

    Základní nátěr A-2

    ■ Špatná kvalita primerů-Znovu syntetizujte primer.

    ■ Degradace primerů —— Alikvotujte primery s vysokou koncentrací do malého objemu pro uchování. Vyvarujte se vícenásobného zmrazení a rozmrazení nebo dlouhodobé kryokonzervované na 4 ° C.

    ■ Nesprávný design primerů (např. Nedostatečná délka primeru, dimer vytvořený mezi primery atd.) -Přepracovat primery (vyhnout se tvorbě dimeru primeru a sekundární struktury)

    A-3 Mg2+koncentrace

    ■ Mg2+ koncentrace je příliš nízká —— Správně zvyšte Mg2+ koncentrace: Optimalizujte Mg2+ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg2+ koncentrace pro každý templát a primer.

    A-4 Teplota žíhání

    ■ Vysoká teplota žíhání ovlivňuje vazbu primeru a šablony. —— Snižte teplotu žíhání a optimalizujte stav s gradientem 2 ° C.

    A-5 Doba prodloužení

    ■ Krátká doba prodloužení —— Prodlužte dobu prodloužení.

    Otázka: Falešně pozitivní

    Fenomény: Negativní vzorky také ukazují pásma cílové sekvence.

    A-1 Kontaminace PCR

    ■ Křížová kontaminace cílové sekvence nebo amplifikačních produktů —— Opatrně nepipetujte vzorek obsahující cílovou sekvenci do negativního vzorku ani je nevylijte z centrifugační zkumavky. Činidla nebo zařízení by měla být autoklávována, aby se odstranily stávající nukleové kyseliny, a existence kontaminace by měla být stanovena pomocí experimentů s negativní kontrolou.

    ■ Kontaminace reagencií ——Realizujte reagencie a skladujte při nízké teplotě.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ koncentrace je příliš nízká —— Správně zvyšte Mg2+ koncentrace: Optimalizujte Mg2+ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg2+ koncentrace pro každý templát a primer.

    ■ Nesprávný design primerů a cílová sekvence má homologii s necílovou sekvencí. —— Přepracovat základní nátěry.

    Otázka: Nespecifické zesílení

    Jev: Pásy amplifikace PCR jsou v rozporu s očekávanou velikostí, buď velké nebo malé, nebo se někdy vyskytují jak specifické amplifikační pásy, tak nespecifické amplifikační pásy.

    Základní nátěr A-1

    ■ Špatná specificita primeru

    —— Re-design primer.

    ■ Koncentrace primeru je příliš vysoká —— Správně zvyšte denaturační teplotu a prodlužte denaturační čas.

    A-2 Mg2+ koncentrace

    ■ Mg2+ koncentrace je příliš vysoká —— Správně snižte koncentraci Mg2+: Optimalizujte Mg2+ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg2+ koncentrace pro každý templát a primer.

    A-3 Termostabilní polymeráza

    ■ Nadměrné množství enzymu —— Množství enzymu přiměřeně snižte v intervalech 0,5 U.

    A-4 Teplota žíhání

    ■ Teplota žíhání je příliš nízká —— Vhodně zvyšte teplotu žíhání nebo použijte dvoustupňovou metodu žíhání

    A-5 PCR cykly

    ■ Příliš mnoho cyklů PCR — Snižte počet cyklů PCR.

    Otázka: Nepravidelné nebo rozmazané pásy

    Základní nátěr A-1——Špatná specifičnost ——Předělejte základní nátěr, změňte polohu a délku základního nátěru, abyste zvýšili jeho specifičnost; nebo proveďte vnořenou PCR.

    A-2 DNA šablony

    ——Šablona není čistá —— Purifikujte šablonu nebo extrahujte DNA pomocí purifikačních souprav.

    A-3 Mg2+ koncentrace

    ——Mg2+ koncentrace je příliš vysoká —— Správně snižte Mg2+ koncentrace: Optimalizujte Mg2+ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg2+ koncentrace pro každý templát a primer.

    A-4 dNTP

    ——Koncentrace dNTP je příliš vysoká —— Vhodně snižte koncentraci dNTP

    A-5 Teplota žíhání

    —— Příliš nízká teplota žíhání —— Vhodně zvyšte teplotu žíhání

    A-6 Cykly

    ——Příliš mnoho cyklů ——Optimalizujte počet cyklů

    Otázka: Kolik templátové DNA by mělo být přidáno do 50 μl reakčního systému PCR?
    ytry
    Otázka: Jak zesílit dlouhé fragmenty?

    Prvním krokem je výběr vhodné polymerázy. Běžná Taq polymeráza nemůže být zkontrolována kvůli nedostatku aktivity 3'-5 'exonukleázy a nesoulad výrazně sníží účinnost extenze fragmentů. Pravidelná Taq polymeráza proto nemůže účinně zesilovat cílové fragmenty větší než 5 kb. Taq polymeráza se speciální modifikací nebo jinou vysoce věrnou polymerázou by měla být zvolena tak, aby se zlepšila účinnost extenze a splnily potřeby amplifikace dlouhým fragmentem. Navíc amplifikace dlouhých fragmentů také vyžaduje odpovídající úpravu designu primerů, denaturační doby, prodlužovací doby, pH pufru atd. Obvykle mohou primery s 18-24 bp vést k lepšímu výtěžku. Aby se zabránilo poškození templátu, měla by být denaturační doba při 94 ° C snížena na 30 sekund nebo méně na cyklus a doba pro zvýšení teploty na 94 ° C před amplifikací by měla být kratší než 1 min. Účinnou amplifikaci dlouhých fragmentů lze navíc zajistit nastavením teploty extenze na přibližně 68 ° C a navržením doby prodloužení podle rychlosti 1 kb/min.

    Otázka: Jak zlepšit věrnost amplifikace PCR?

    Chybovost PCR amplifikace může být snížena použitím různých DNA polymeráz s vysokou věrností. Ze všech dosud nalezených Taq DNA polymeráz má enzym Pfu nejnižší chybovost a nejvyšší věrnost (viz přiložená tabulka). Kromě výběru enzymů mohou vědci dále snížit rychlost mutace PCR optimalizací reakčních podmínek, včetně optimalizace složení pufru, koncentrace termostabilní polymerázy a optimalizace počtu cyklů PCR.

    Sem napište svoji zprávu a pošlete nám ji