Blood Direct PCR Kit

Rychlá amplifikace cílového genu přímo s použitím krve jako templátu bez extrakce.

Tato souprava využívá geneticky upravenou anti-inhibitorovou DNA polymerázu k účinné amplifikaci genů s jednou kopií v lidském genomu. Dobře optimalizovaný pufrový systém v této soupravě pomáhá polymerázě silně odolávat inhibici inhibitorů PCR, takže může přímo amplifikovat DNA pomocí krve a kultivovaných buněk jako templátů. Tento produkt je snadno ovladatelný a nevyžaduje složité kroky, jako je čištění DNA nebo předúprava vzorku.
Tato sada je dodávána jako 2 × MasterMix a reakci lze provést jednoduchým přidáním templátu krve a odpovídajících detekčních primerů. Může být aplikován na kultivované buňky savců, jako jsou lidé, myši, prasata, skot a další druhy, stejně jako čerstvou nebo 4 ° C kryokonzervovanou plnou krev, antikoagulant (EDTA, citrát, heparin), zkapalněné krevní sraženiny a suché krevní skvrny uloženy na komerčních kartách Whatman 903 a FTA Elute.

Kočka. Ne	Velikost balení
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Pošlete nám e -mail

Detail produktu

Experimentální příklad

FAQ

Značky produktů

Funkce

■ Jednoduché a rychlé: Amplifikaci PCR lze přímo provést pomocí krve jako templátu, aniž by bylo nutné provádět zdlouhavé kroky přípravy vzorku a extrakce DNA.
■ Vysoká čistota: Vynechání kroků předúpravy vzorků a extrakce DNA může pomoci zabránit křížové kontaminaci vzorků.
■ Vysoká průchodnost: Identifikaci PCR pro vzorky ve velkém měřítku lze provést kombinací soupravy s 96/384jamkovými destičkami PCR.
■ Silná univerzálnost: Tato sada může účinně zesilovat fragmenty s vysokým GC nebo fragmenty se složitou sekundární strukturou a délka amplifikace může být až 5 kb.
■ Silná odolnost vůči stresu: Tuto soupravu lze použít pro různé druhy a vzorky krve konzervované různými způsoby.

Aplikace

Produkty PCR této soupravy obsahují na 3'-konci „A“, které lze přímo použít pro klonování vektoru TA. Tuto soupravu lze použít pro amplifikaci fragmentů genomové DNA, vysokovýkonnou genetickou analýzu a analýzu genotypizace (jako je detekce genů).

Všechny produkty lze přizpůsobit pro ODM/OEM. Pro detaily,klikněte prosím na přizpůsobenou službu (ODM/OEM)

Předchozí: Kit TIANcombi DNA Lyse & Det PCR

Další: Souprava PCR pro myší tkáň

	Pomocí antikoagulace lidské EDTA jako templátu byly pomocí Blood Direct PCR Kit amplifikovány 4 geny s různým obsahem GC. Reakční systém PCR byl 20 μl a jako templát byl použit 1 μl krve. M: TIANGEN Marker II; 1: Velikost fragmentu 1090 bp, obsah GC 68,1%; 2: Velikost fragmentu 1915 bp, obsah GC 70,4%; 3: Velikost fragmentu 448 bp, obsah GC 74,8%; 4: Velikost fragmentu 1527 bp, obsah GC 61,5%. Experimentální výsledky: Souprava Blood Direct PCR může účinně amplifikovat fragmenty DNA s obsahem GC v rozmezí 61,5%-74,8%, což naznačuje, že je schopná amplifikovat fragmenty s vysokým GC.
	Pomocí antikoagulace lidské EDTA jako templátu bylo pomocí Blood Direct PCR Kit amplifikováno 5 genů s různou délkou (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 a Hn4.0). Reakční systém PCR byl 20 μl a jako templát byl použit 1 μl krve. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 různé vzorky krve; NTC: ovládání bez primerů. Experimentální výsledky: Souprava Blood Direct PCR Kit může amplifikovat fragmenty o délce až 4 kb, což naznačuje, že je schopná amplifikovat dlouhé fragmenty.
	Pomocí antikoagulace lidské EDTA jako šablony byla použita souprava Blood Direct PCR pro detekci různých vzorků krve pomocí PCR. Reakční systém PCR byl 20 μl a jako templát byl použit 1 μl krve. M: TIANGEN Marker II; 1-9: nasycené množství krve je 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, respektive 5 μl; NTC: kontrola bez šablony Experimentální výsledky: Souprava Blood Direct PCR Kit má silnou odolnost vůči krvi a může amplifikovat vzorky krve s rozsahem plnění 0,1–5 μl.
	Jako šablony byly použity vzorky krve z lidí, krys, kuřat a dalších druhů s různým ošetřením. K amplifikaci PRNP (lidský, 750 bp), aktinu (krysa, 200 bp) a p-aktinu (kuře, 1,0 kb) byla použita souprava Blood Direct PCR. Reakční systém PCR byl 20 μl a jako templát byl použit 1 μl krve. M: TIANGEN Marker II. Experimentální výsledky: Kit Blood Direct PCR Kit lze použít na širokou škálu vzorků a přímou detekci PCR lze provést na krevních vzorcích různých druhů s různým ošetřením.

Otázka: Žádná pásma zesílení

Šablona A-1

■ Šablona obsahuje proteinové nečistoty nebo inhibitory Taq atd. —— Čistěte templát DNA, odstraňte proteinové nečistoty nebo extrahujte templátovou DNA pomocí purifikačních souprav.

■ Denaturace šablony není úplná —— Vhodně zvyšte denaturační teplotu a prodlužte denaturační čas.

■ Degradace šablony —— Připravte šablonu znovu.

Základní nátěr A-2

■ Špatná kvalita primerů-Znovu syntetizujte primer.

■ Degradace primerů —— Alikvotujte primery s vysokou koncentrací do malého objemu pro uchování. Vyvarujte se vícenásobného zmrazení a rozmrazení nebo dlouhodobé kryokonzervované na 4 ° C.

■ Nesprávný design primerů (např. Nedostatečná délka primeru, dimer vytvořený mezi primery atd.) -Přepracovat primery (vyhnout se tvorbě dimeru primeru a sekundární struktury)

A-3 Mg²⁺koncentrace

■ Mg²⁺ koncentrace je příliš nízká —— Správně zvyšte Mg²⁺koncentrace: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

A-4 Teplota žíhání

■ Vysoká teplota žíhání ovlivňuje vazbu primeru a šablony. —— Snižte teplotu žíhání a optimalizujte stav s gradientem 2 ° C.

A-5 Doba prodloužení

■ Krátká doba prodloužení —— Prodlužte dobu prodloužení.

Otázka: Falešně pozitivní

Fenomény: Negativní vzorky také ukazují pásma cílové sekvence.

A-1 Kontaminace PCR

■ Křížová kontaminace cílové sekvence nebo amplifikačních produktů —— Opatrně nepipetujte vzorek obsahující cílovou sekvenci do negativního vzorku ani je nevylijte z centrifugační zkumavky. Činidla nebo zařízení by měla být autoklávována, aby se odstranily stávající nukleové kyseliny, a existence kontaminace by měla být stanovena pomocí experimentů s negativní kontrolou.

■ Kontaminace reagencií ——Realizujte reagencie a skladujte při nízké teplotě.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentrace je příliš nízká —— Správně zvyšte Mg²⁺ koncentrace: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

■ Nesprávný design primerů a cílová sekvence má homologii s necílovou sekvencí. —— Přepracovat základní nátěry.

Otázka: Nespecifické zesílení

Jev: Pásy amplifikace PCR jsou v rozporu s očekávanou velikostí, buď velké nebo malé, nebo se někdy vyskytují jak specifické amplifikační pásy, tak nespecifické amplifikační pásy.

Základní nátěr A-1

■ Špatná specificita primeru

—— Re-design primer.

■ Koncentrace primeru je příliš vysoká —— Správně zvyšte denaturační teplotu a prodlužte denaturační čas.

A-2 Mg²⁺ koncentrace

■ Mg²⁺ koncentrace je příliš vysoká —— Správně snižte koncentraci Mg2+: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

A-3 Termostabilní polymeráza

■ Nadměrné množství enzymu —— Množství enzymu přiměřeně snižte v intervalech 0,5 U.

A-4 Teplota žíhání

■ Teplota žíhání je příliš nízká —— Vhodně zvyšte teplotu žíhání nebo použijte dvoustupňovou metodu žíhání

A-5 PCR cykly

■ Příliš mnoho cyklů PCR — Snižte počet cyklů PCR.

Otázka: Nepravidelné nebo rozmazané pásy

Základní nátěr A-1——Špatná specifičnost ——Předělejte základní nátěr, změňte polohu a délku základního nátěru, abyste zvýšili jeho specifičnost; nebo proveďte vnořenou PCR.

A-2 DNA šablony

——Šablona není čistá —— Purifikujte šablonu nebo extrahujte DNA pomocí purifikačních souprav.

A-3 Mg²⁺ koncentrace

——Mg²⁺ koncentrace je příliš vysoká —— Správně snižte Mg²⁺ koncentrace: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

A-4 dNTP

——Koncentrace dNTP je příliš vysoká —— Vhodně snižte koncentraci dNTP

A-5 Teplota žíhání

—— Příliš nízká teplota žíhání —— Vhodně zvyšte teplotu žíhání

A-6 Cykly

——Příliš mnoho cyklů ——Optimalizujte počet cyklů

Otázka: Kolik templátové DNA by mělo být přidáno do 50 μl reakčního systému PCR?

Otázka: Jak zesílit dlouhé fragmenty?

Prvním krokem je výběr vhodné polymerázy. Běžná Taq polymeráza nemůže být zkontrolována kvůli nedostatku aktivity 3'-5 'exonukleázy a nesoulad výrazně sníží účinnost extenze fragmentů. Pravidelná Taq polymeráza proto nemůže účinně zesilovat cílové fragmenty větší než 5 kb. Taq polymeráza se speciální modifikací nebo jinou vysoce věrnou polymerázou by měla být zvolena tak, aby se zlepšila účinnost extenze a splnily potřeby amplifikace dlouhým fragmentem. Navíc amplifikace dlouhých fragmentů také vyžaduje odpovídající úpravu designu primerů, denaturační doby, prodlužovací doby, pH pufru atd. Obvykle mohou primery s 18-24 bp vést k lepšímu výtěžku. Aby se zabránilo poškození templátu, měla by být denaturační doba při 94 ° C snížena na 30 sekund nebo méně na cyklus a doba pro zvýšení teploty na 94 ° C před amplifikací by měla být kratší než 1 min. Účinnou amplifikaci dlouhých fragmentů lze navíc zajistit nastavením teploty extenze na přibližně 68 ° C a navržením doby prodloužení podle rychlosti 1 kb/min.

Otázka: Jak zlepšit věrnost amplifikace PCR?

Chybovost PCR amplifikace může být snížena použitím různých DNA polymeráz s vysokou věrností. Ze všech dosud nalezených Taq DNA polymeráz má enzym Pfu nejnižší chybovost a nejvyšší věrnost (viz přiložená tabulka). Kromě výběru enzymů mohou vědci dále snížit rychlost mutace PCR optimalizací reakčních podmínek, včetně optimalizace složení pufru, koncentrace termostabilní polymerázy a optimalizace počtu cyklů PCR.

Sem napište svoji zprávu a pošlete nám ji