2 × Pfu PCR Mix

Šablona A-1

■ Šablona obsahuje proteinové nečistoty nebo inhibitory Taq atd. —— Čistěte templát DNA, odstraňte proteinové nečistoty nebo extrahujte templátovou DNA pomocí purifikačních souprav.

■ Denaturace šablony není úplná —— Vhodně zvyšte denaturační teplotu a prodlužte denaturační čas.

■ Degradace šablony —— Připravte šablonu znovu.

Základní nátěr A-2

■ Špatná kvalita primerů-Znovu syntetizujte primer.

■ Degradace primerů —— Alikvotujte primery s vysokou koncentrací do malého objemu pro uchování. Vyvarujte se vícenásobného zmrazení a rozmrazení nebo dlouhodobé kryokonzervované na 4 ° C.

■ Nesprávný design primerů (např. Nedostatečná délka primeru, dimer vytvořený mezi primery atd.) -Přepracovat primery (vyhnout se tvorbě dimeru primeru a sekundární struktury)

A-3 Mg²⁺koncentrace

■ Mg²⁺ koncentrace je příliš nízká —— Správně zvyšte Mg²⁺ koncentrace: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

A-4 Teplota žíhání

■ Vysoká teplota žíhání ovlivňuje vazbu primeru a šablony. —— Snižte teplotu žíhání a optimalizujte stav s gradientem 2 ° C.

A-5 Doba prodloužení

■ Krátká doba prodloužení —— Prodlužte dobu prodloužení.

Fenomény: Negativní vzorky také ukazují pásma cílové sekvence.

A-1 Kontaminace PCR

■ Křížová kontaminace cílové sekvence nebo amplifikačních produktů —— Opatrně nepipetujte vzorek obsahující cílovou sekvenci do negativního vzorku ani je nevylijte z centrifugační zkumavky. Činidla nebo zařízení by měla být autoklávována, aby se odstranily stávající nukleové kyseliny, a existence kontaminace by měla být stanovena pomocí experimentů s negativní kontrolou.

■ Kontaminace reagencií ——Realizujte reagencie a skladujte při nízké teplotě.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentrace je příliš nízká —— Správně zvyšte Mg²⁺ koncentrace: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

■ Nesprávný design primerů a cílová sekvence má homologii s necílovou sekvencí. —— Přepracovat základní nátěry.

Jev: Pásy amplifikace PCR jsou v rozporu s očekávanou velikostí, buď velké nebo malé, nebo se někdy vyskytují jak specifické amplifikační pásy, tak nespecifické amplifikační pásy.

Základní nátěr A-1

■ Špatná specificita primeru

—— Re-design primer.

■ Koncentrace primeru je příliš vysoká —— Správně zvyšte denaturační teplotu a prodlužte denaturační čas.

A-2 Mg²⁺ koncentrace

■ Mg²⁺ koncentrace je příliš vysoká —— Správně snižte koncentraci Mg2+: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

A-3 Termostabilní polymeráza

■ Nadměrné množství enzymu —— Množství enzymu přiměřeně snižte v intervalech 0,5 U.

A-4 Teplota žíhání

■ Teplota žíhání je příliš nízká —— Vhodně zvyšte teplotu žíhání nebo použijte dvoustupňovou metodu žíhání

A-5 PCR cykly

■ Příliš mnoho cyklů PCR — Snižte počet cyklů PCR.

Základní nátěr A-1——Špatná specifičnost ——Předělejte základní nátěr, změňte polohu a délku základního nátěru, abyste zvýšili jeho specifičnost; nebo proveďte vnořenou PCR.

A-2 DNA šablony

——Šablona není čistá —— Purifikujte šablonu nebo extrahujte DNA pomocí purifikačních souprav.

A-3 Mg²⁺ koncentrace

——Mg²⁺ koncentrace je příliš vysoká —— Správně snižte Mg²⁺ koncentrace: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrace sérií reakcí od 1 mM do 3 mM s intervalem 0,5 mM pro stanovení optimálního Mg²⁺ koncentrace pro každý templát a primer.

A-4 dNTP

——Koncentrace dNTP je příliš vysoká —— Vhodně snižte koncentraci dNTP

A-5 Teplota žíhání

—— Příliš nízká teplota žíhání —— Vhodně zvyšte teplotu žíhání

A-6 Cykly

——Příliš mnoho cyklů ——Optimalizujte počet cyklů

Prvním krokem je výběr vhodné polymerázy. Běžná Taq polymeráza nemůže být zkontrolována kvůli nedostatku aktivity 3'-5 'exonukleázy a nesoulad výrazně sníží účinnost extenze fragmentů. Pravidelná Taq polymeráza proto nemůže účinně zesilovat cílové fragmenty větší než 5 kb. Taq polymeráza se speciální modifikací nebo jinou vysoce věrnou polymerázou by měla být zvolena tak, aby se zlepšila účinnost extenze a splnily potřeby amplifikace dlouhým fragmentem. Navíc amplifikace dlouhých fragmentů také vyžaduje odpovídající úpravu designu primerů, denaturační doby, prodlužovací doby, pH pufru atd. Obvykle mohou primery s 18-24 bp vést k lepšímu výtěžku. Aby se zabránilo poškození templátu, měla by být denaturační doba při 94 ° C snížena na 30 sekund nebo méně na cyklus a doba pro zvýšení teploty na 94 ° C před amplifikací by měla být kratší než 1 min. Účinnou amplifikaci dlouhých fragmentů lze navíc zajistit nastavením teploty extenze na přibližně 68 ° C a navržením doby prodloužení podle rychlosti 1 kb/min.

Chybovost PCR amplifikace může být snížena použitím různých DNA polymeráz s vysokou věrností. Ze všech dosud nalezených Taq DNA polymeráz má enzym Pfu nejnižší chybovost a nejvyšší věrnost (viz přiložená tabulka). Kromě výběru enzymů mohou vědci dále snížit rychlost mutace PCR optimalizací reakčních podmínek, včetně optimalizace složení pufru, koncentrace termostabilní polymerázy a optimalizace počtu cyklů PCR.